關(guān)鍵詞：菌種分離純化 純菌種 固體培養(yǎng)基 稀釋平板 涂布平板 平板劃線 液體培養(yǎng)基 單細(xì)胞分離 選擇培養(yǎng)分離 菌懸液 培養(yǎng)基 無菌操作

菌種分離與純化是微生物學(xué)研究中的關(guān)鍵步驟，旨在從復(fù)雜的微生物群體中分離出單一、純凈的菌株，為后續(xù)的科學(xué)研究、工業(yè)應(yīng)用及醫(yī)療診斷提供基礎(chǔ)材料。本文概述了菌種分離與純化的多種方法，包括固體培養(yǎng)基分離法（如稀釋倒平板法、涂布平板法、平板劃線法等）、液體培養(yǎng)基分離法、單細(xì)胞分離法以及選擇培養(yǎng)分離法等。這些方法各有特點，適用于不同類型的微生物和不同的研究需求。此外，對于特殊類型的微生物，如厭氧菌、嗜熱菌等，還需采用特殊的分離與純化策略。

一、菌種分離與純化的定義

菌種分離純化是指通過無菌操作技術(shù)，將所需要的純種菌通過一系列方法從菌落或菌群中單獨分離出來達(dá)到純培養(yǎng)狀態(tài)，即只含有單一的微生物種類。

二、菌種分離與純化的方法

1. 固體培養(yǎng)基分離法

固體培養(yǎng)基分離法是常用的菌種分離與純化方法，主要包括以下幾種：

（1）稀釋倒平板法：將菌懸液按一定梯度稀釋后，分別取少許不同梯度的菌液（0.5-1.0ml）與熔化的瓊脂培養(yǎng)基搖勻混合，倒入無菌平皿中，待瓊脂凝固后將平板放入恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。如果稀釋得當(dāng)，平板上會出現(xiàn)分散的單個菌落，挑取這些菌落重復(fù)1-2次上述步驟即可獲得純培養(yǎng)。但該方法不適用于熱敏感菌的死亡或好氧菌的純培養(yǎng)。

圖示為稀釋倒平板法

（2）涂布平板法：將熔化的瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌平皿中制成平板，待平板冷卻凝固后，將按梯度稀釋的菌懸液加入平板中，每個平板加入0.1ml，并用無菌玻璃涂棒均勻涂布，涂布完成后將平板放入恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后挑取單個菌落進(jìn)行純化。該方法克服了稀釋倒平板法的部分缺點，適用于更多種類的微生物。

圖示為涂布平板法

（3）平板劃線法：用接種環(huán)或接種針沾取少量菌懸液，在無菌平板表面連續(xù)劃線。隨著劃線次數(shù)的增加，微生物細(xì)胞數(shù)量逐漸減少并分散開來，最終形成單個菌落。重復(fù)上述步驟1-2次即可獲得純種菌種。該方法簡便快速，但可能需要多次劃線以確保純培養(yǎng)。常用方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。

圖示為平板劃線法

2. 液體培養(yǎng)基分離法

對于某些在固體培養(yǎng)基上難以生長的微生物，可以采用液體培養(yǎng)基進(jìn)行分離與純化。常用的方法是稀釋法，即將需要培養(yǎng)的微生物在液體培養(yǎng)基中按梯度稀釋，以達(dá)到高度稀釋的效果。在同一梯度的多個平行試管中培養(yǎng)后，若大部分試管（一般為超過95%的試管）沒有微生物生長，選擇有微生物生長的試管，其中可能含有純培養(yǎng)物。但該方法只能分離出數(shù)量占優(yōu)勢的微生物種類。

圖示為液體培養(yǎng)基法

3. 單細(xì)胞分離法

單細(xì)胞分離法是將單個細(xì)胞或個體直接從微生物材料中分離出來進(jìn)行純培養(yǎng)的過程。對于個體較小的微生物如細(xì)菌等，可以采用在顯微操作儀下用顯微針挑取的方法進(jìn)行純培養(yǎng)；對于個體較大的微生物如原生動物等，可以在顯微鏡下用毛細(xì)管提取進(jìn)行純培養(yǎng)；也可以將菌懸液稀釋后制成小液滴，在顯微鏡下挑選只含有一個細(xì)胞的液滴進(jìn)行純培養(yǎng)。該方法通常需要在顯微鏡下進(jìn)行，利用顯微操作儀或毛細(xì)管等工具挑取單個微生物細(xì)胞或孢子進(jìn)行培養(yǎng)。因此該方法對操作技術(shù)要求較高，多用于某些高度專業(yè)化的科學(xué)研究。

圖示為單細(xì)胞分離法

4. 選擇培養(yǎng)分離法

根據(jù)待分離微生物的特點（如營養(yǎng)需求、生長條件等），設(shè)計特定的環(huán)境條件進(jìn)行培養(yǎng)。通過抑制其他微生物的生長或促進(jìn)目標(biāo)微生物的生長，使目標(biāo)微生物在群落中的數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法進(jìn)行純培養(yǎng)分離。這種方法特別適用于從自然界中分離、尋找有用的微生物。

圖示為選擇培養(yǎng)分離法

三、菌種分離與純化的注意事項

1.在進(jìn)行菌種分離與純化時，必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，以防止雜菌的污染。

2.選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對于成功分離與純化微生物至關(guān)重要。

3.在挑取單菌落進(jìn)行純化時，應(yīng)反復(fù)進(jìn)行多次以確保獲得真正的純培養(yǎng)物。

4.對于某些特殊類型的微生物（如厭氧菌、嗜熱菌等），需要采用特殊的分離與純化方法。

綜上所述，菌種分離與純化是微生物學(xué)中的一項重要技術(shù)，選擇合適的分離與純化方法并嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，可以成功地從混雜的微生物群體中分離出單一的、純凈的微生物菌株。通過菌種分離與純化，可以獲得具有特定生物學(xué)特性和應(yīng)用價值的微生物資源，為微生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展做出重要貢獻(xiàn)。